Trong lĩnh vực sinh học phân tử, PCR (Polymerase Chain Reaction) và Real-time PCR là hai kỹ thuật quan trọng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chẩn đoán. Mỗi kỹ thuật có những đặc điểm riêng biệt, đóng vai trò thiết yếu trong việc phát hiện và phân tích gene mục tiêu. Bài viết này sẽ phân tích chi tiết về nguyên tắc hoạt động, điểm tương đồng cũng như sự khác nhau của PCR và Real Time PCR.
PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử được phát triển nhằm nhân bản một đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần trong môi trường in vitro. Quá trình này mô phỏng cơ chế sao chép DNA tự nhiên nhưng được thực hiện trong phòng thí nghiệm với sự điều chỉnh nhiệt độ theo chu kỳ.
Nguyên tắc của PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) dựa trên nguyên lý sao chép DNA trong tế bào, tuy cả hai đều liên quan đến việc tổng hợp DNA nhưng có những đặc điểm khác biệt rõ rệt.
Sao chép DNA là một quá trình sinh học tự nhiên nhằm tạo ra hai bản sao DNA giống hệt nhau từ một phân tử DNA ban đầu, còn được gọi là tổng hợp DNA in vivo. Quá trình này diễn ra liên tục, yêu cầu độ chính xác cao và có mục đích chính là nhân bản toàn bộ hệ gene để phục vụ sự phân chia tế bào.
Ngược lại, PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được thực hiện in vitro nhằm tạo ra nhiều bản sao của một đoạn DNA cụ thể trong môi trường nhân tạo. PCR không liên tục mà diễn ra theo số chu kỳ xác định và có thể chịu tác động bởi các thành phần phản ứng hoặc điều kiện bên ngoài.
Thành phần cơ bản trong một phản ứng PCR gồm:
DNA khuôn: Mẫu DNA chứa đoạn gene mục tiêu cần khuếch đại.
Cặp mồi (primers): Đoạn oligonucleotide ngắn xác định vị trí bắt đầu và kết thúc của quá trình khuếch đại.
DNA polymerase: Enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi DNA mới.
dNTPs: Các nucleotide tự do cung cấp nguyên liệu cho tổng hợp DNA.
Dung dịch đệm: Đảm bảo điều kiện tối ưu cho hoạt động của DNA polymerase.
Sau khi chuẩn bị đủ các thành phần, ống phản ứng sẽ được đặt vào máy luân nhiệt (PCR machine), nơi đã cài đặt chu trình nhiệt phù hợp. Quá trình khuếch đại sẽ trải qua các bước gia nhiệt, giảm nhiệt và kéo dài theo chu kỳ để nhân bản đoạn DNA mục tiêu.
Real-time PCR (qPCR) là một phiên bản cải tiến của PCR truyền thống, cho phép theo dõi và định lượng DNA mục tiêu trong thời gian thực nhờ công nghệ huỳnh quang. Kỹ thuật này không chỉ phát hiện mà còn xác định được nồng độ DNA mục tiêu trong mẫu ban đầu.
Nguyên tắc của Real-time PCR
Real-time PCR hay còn gọi là Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), về cơ bản vẫn dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR. Phương pháp này sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhận biết và khuếch đại một trình tự DNA mục tiêu thông qua việc thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ.
Điểm khác biệt nổi bật của Real-time PCR là việc tích hợp các mẫu dò hoặc thuốc nhuộm phát huỳnh quang gắn với DNA mục tiêu. Những chất này cho phép theo dõi trực tiếp sự gia tăng số lượng bản sao DNA mục tiêu trong suốt quá trình phản ứng. Tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận liên tục và đo lường trong thời gian thực, cung cấp thông tin về hiệu quả khuếch đại DNA (Mackay, 2004).
Cụ thể, khi phản ứng nhân bản đạt đến một chu kỳ nhất định, tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng rõ rệt, phản ánh sự gia tăng số lượng bản sao DNA. Dữ liệu được hiển thị trên màn hình máy tính dưới dạng biểu đồ, cho phép quan sát chi tiết sự biến đổi qua từng chu kỳ và đánh giá hiệu quả khuếch đại của phản ứng.
Để thực hiện Real-time PCR, cần sử dụng các thiết bị chuyên dụng có khả năng đo cường độ huỳnh quang từ ống phản ứng. Đồng thời, phần mềm được cài đặt trên máy sẽ xử lý và phân tích kết quả thể hiện sự biến đổi tín hiệu huỳnh quang một cách trực quan và chính xác.
Mặc dù có nhiều cải tiến, qPCR vẫn giữ nguyên các đặc điểm cơ bản của PCR truyền thống. Dưới đây là những điểm tương đồng giữa hai kỹ thuật:
Nguyên tắc cơ bản: Cả hai đều dựa trên quá trình nhân bản DNA mục tiêu thông qua sự gắn mồi đặc hiệu.
Thành phần phản ứng: Đều cần các thành phần như DNA khuôn, cặp mồi, DNA polymerase, dNTP và dung dịch đệm.
Sử dụng máy luân nhiệt: Quá trình thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ là yếu tố cốt lõi trong cả hai kỹ thuật.
Ứng dụng: Cả hai được sử dụng để phát hiện tác nhân gây bệnh, phân tích gene và nhiều mục đích nghiên cứu khác.
Dưới đây là bảng so sánh các điểm khác nhau giữa PCR và Real-time PCR để dễ dàng nhận biết:
|
Tiêu chí |
PCR |
Real-time PCR |
|
Phương pháp đọc kết quả |
Kết quả được đọc sau khi hoàn tất phản ứng. Cần sử dụng điện di gel agarose để quan sát vạch DNA. |
Theo dõi kết quả trong thời gian thực khi phản ứng diễn ra. Kết quả hiển thị qua biểu đồ tín hiệu huỳnh quang. |
|
Thời gian thực hiện |
Tổng thời gian từ 3-4 giờ. |
Tổng thời gian chỉ từ 1,5 - 2 giờ. |
|
Khả năng định lượng |
Chỉ phát hiện sự hiện diện hoặc không của DNA mục tiêu (định tính). |
Định lượng chính xác nồng độ DNA mục tiêu trong mẫu thử. |
|
Ứng dụng |
Thích hợp cho nghiên cứu cơ bản và xác định sự hiện diện của gene mục tiêu. |
Ưu tiên trong chẩn đoán lâm sàng, nghiên cứu định lượng và các ứng dụng cần độ nhạy cao. |
|
Thiết bị và chi phí |
Thiết bị đơn giản hơn, chi phí thấp hơn. |
Máy móc hiện đại với khả năng phát hiện huỳnh quang, chi phí cao hơn. |
PCR và Real-time PCR là hai kỹ thuật quan trọng trong sinh học phân tử, mỗi kỹ thuật có những ưu điểm và ứng dụng riêng biệt. PCR phù hợp với các nghiên cứu cơ bản trong khi Real-time PCR tối ưu hơn cho chẩn đoán và phân tích định lượng. Hiểu rõ đặc điểm, ứng dụng và sự khác nhau của PCR và Real Time PCR sẽ giúp các kỹ thuật viên lựa chọn phương pháp phù hợp nhất cho nghiên cứu và chẩn đoán
